Biosensorite ja antibiootikumide lugu

      

Biosensoriteks nimetatakse analüüside läbiviimiseks kasutatavaid instrumente, milles tundliku elemendi rolli täidab bioloogiline materjal. Viimase paarikümne aasta jooksul on uurimisgrupid üle maailma loonud biosensoreid mitmesuguste ühendite tuvastamiseks ja väga erinevate analüüside teostamiseks. Tuleb nentida, et esialgu on kaubanduslikult kättesaadav üksnes murdosa tänaseks konstrueeritud biosensoritest. Sellegipoolest lubab sünteetilise bioloogia kiire areng ennustada, et lähitulevikus kujunevad biosensorid laialdaselt kasutatavateks seadmeteks.

 

Bioloogilise materjalina on biosensorites kasutatud ensüüme, antikehasid, organelle, nukleiinhappeid, terveid rakke ja kudesid. Tihti kasutatakse elusatest organismidest eraldatud komponente, kuid mõnel juhul saab need asendada laboris sünteesitud molekulidega. Eriti huvipakkuva rühma moodustavad biosensorid, kus tundliku elemendina toimivad elusad geneetiliselt muundatud bakterirakud. Sisuliselt kujutab iga üksik bakterirakk endast pisikest biosensorit. Selliseid “nutikaid baktereid” nimetatakse ka bioreporteriteks.

 

Teadlased on loodud geneetiliselt muundatud baktereid, keda on “õpetatud” ära tundma kindlaid keemilisi ühendeid. Tingimuseks on, et äratuntavad ühendid peavad olema võimelised bakterirakku sisenema. Vastavate ühendite olemasolule reageerivad bakterid muutustega raku sees, mille tulemusel tekib mõõdetav optiline või elektrokeemiline signaal. Tihti kasutatakse fluorestseeruvaid valke kodeerivaid reportergeene, kuna valgussignaali on lihtne detekteerida. Tuntuim reportergeen on gfp. Selle geeni produkti nimetatakse roheliseks fluorestseeruvaks valguks, sest UV-valguses kiirgab see rohelist värvust. Kõnealune geen leiti meduusist Aequorea victoria ja isoleeriti Washingtoni ülikooli teadlaste poolt juba 1960-tel aastatel. Alles 30 aastat hiljem mõisteti, et gfp sobib suurepäraselt geeniekspressiooni uurimise tööriistaks. Algset gfp geeni on valgu omaduste ja signaali tugevuse parandamiseks modifitseeritud. Tänapäeval tuntakse paljusid fluorestseeruvaid valke kodeerivaid geene. Näiteks kasutatakse uuemates bioreporterites sünteetilist geeni mScarlet, disainiti korallist leitud geeni baasil ja on võimeline kiirgama eredat punast valgust.

 

Üheks potentsiaalseks bioreporterite kasutusvaldkonnaks on keskkonda saastavate ainete avastamine ja nende taseme jälgimine. On konstrueeritud bioloogilisi süsteeme, mis annavad teavet keskkonnas leiduvate pestitsiidide, aeglaselt lagunevate aromaatsete ühendite ja raskemetallide kohta. Samuti võiks bioreportereid kasutada kliiniliseks diagnostikaks, toidu ohutuse ja vee kvaliteedi hindamisel ning isegi lõhkeainete leidmisel.

 

TÜ Tehnoloogiainstituudi antibiootikumide ja molekulaarse mikrobioloogia töörühma doktorant Mariliis Hinnu ja teadur Marta Putrinš arendavad bioreportereid, mille abil saab tuvastada antibiootikumide olemasolu keskkonnas ja uurida nende toimemehhanisme. Eksperimentides on mudelorganismina kasutusel soolekepike Escherichia coli. Paralleelselt käib töö mitme bioreporteri tüübiga, mis on võimelised ära tundma erinevaid antibiootikumide liike. Hiljuti tutvustas Mariliis Hinnu enda tegemisi Amsterdamis toimunud Euroopa Kliinilise Mikrobioloogia ja Nakkushaiguste Kongressil.

 

Üheks Tartu teadlaste uurimissuunaks on bioreporterid, mis reageerivad DNA kahjustusele. Sellised bioreporterid võimaldavad detekteerida fluorokinoloonide rühma kuuluvaid antibiootikume, kuna nende ravimite toimemehhanism seisnebki bakterite DNA kahjustamises. Bioreporteriteks muundatud bakterid sisaldavad kromosoomivälist DNA molekuli ehk plasmiidi, millel paiknevad järjestikku geenid gfp ja mScarlet. Tavaolekus ekspresseerib bioreporter rohelist valku ja punase valgu süntees on takistatud. Kui aga rakku satub DNA-d kahjustav fluorokinoloon, lülitub tööle punast valku kodeeriva geeni ekspressioon. Mida suurem on fluorokinolooni kogus, seda intensiivsemalt toodab bioreporter punast valku. Roheline valk võimaldab hinnata raku üldist ekspressioonitaset ja mõõta reportervalgu taset kvantitatiivselt. Fluorestseeruvate valkude kasutamine muudab kogu analüüsi lihtsaks. Bioreporterite rakke pole vaja lüüsida, kuna helendavat signaali saab detekteerida ka elavatest bakteritest üksikraku tasemel.

 

Tehnoloogiainstituudi laboris arendatakse bioreporterid, mis detekteerivad ka teist liiki antibiootikume, näiteks valgusünteesi takistavat klooramfenikooli. Need bioreporterid sisaldavad samuti plasmiidi, millel paiknevad järjestikku rohelise ja punase valgu geenid. Kahe geeni vahel asuv piirkond võib RNA-ks sünteesituna voltuda erinevatesse struktuuridesse. Normaalse kiire valgusünteesi korral tekib reportergeenide vahele RNA struktuur, mis tähistab transkriptsiooni terminatsiooni ja bioreporter helendab roheliselt. Kui bioreporterisse satub valgusünteesi takistav klooramfenikool, siis termineerivat struktuuri ei teki ja sünteesitakse ka punast valku. Selle tulemusena värvuvad bioreporterite rakud ka punaseks.

 

Fotol on näha ühe eksperimendi tulemus. Roheliselt helendavale bioreporteritest koosnevale bakterimassile on asetatud klooramfenikooli sisaldavad nanofiibrist kettad. Laialivalguva antibiootikumi mõjul on ketaste ümbruses paiknevate rakkude värvus muutunud.

 

Kõige suurem töö käib kolmandat tüüpi bioreporteritega. Nende abil loodetakse tuvastada antibiootikume, mis põhjustavad vigast valgusünteesi. Sellisteks antibiootikumideks on aminoglükosiidide rühma kuuluvad ühendid. Lisaks võimaldavad sellised bioreporterid uurida, millistel tingimustel tehakse valgusünteesil rohkem vigu. Ka valgusünteesi vigadele reageerivad bioreporterid sisaldavad plasmiidi, millel paiknevad järjestikku rohelist ja punast valgu kodeerivad geenid. Tavaolekus sünteesitakse vaid rohelist valku, sest punase valgu tootmist takistab mScarlet’i geenis olev mutatsioon. Juhul kui ribosoom teeb aminoglükosiidi mõjul mutatsioonikohas vea ning toodetakse täispikkuses punane valk, muutub bioreporterite värvus. Kirjapandut aitab mõista allpool toodud joonis.

 

 

Üheks tänapäeva meditsiini suurimaks probleemiks on kiirelt leviv antibiootikumiresistentsus. See tähendab, et haigust tekitavad bakterid jätkavad paljunemist, kuigi haige tarvitab talle määratud ravimeid. Tagajärjeks võib olla patsiendi surm. Antibiootikumiresistentsusega kaasnevad suured kulutused tervishoiule. Olukorra parandamiseks tuleb pöörata tähelepanu uute ravimite väljatöötamisele. Uusi antibiootikume loodetakse leida nii laboris sünteesitud kemikaalide kui ka mikroobide poolt sünteesitud ühendite hulgast. Kuna turule tuleb siiski väga vähe uusi antibiootikume, tuleb antibiootikumiresistentsuse tekke ennetamiseks uusi ühendeid põhjalikult uurida ja töötada välja optimaalsed annustamisskeemid. Tehnoloogiainstituudi uurimisrühma kaugemaks eesmärgiks ongi luua uudseid meetodeid, mis võimaldaksid uurida antimikroobsete omadustega ainete füsioloogilisi toimeid. Lisaks võimaldab arendatav süsteem töötada välja paremaid antibiootikumide ja nende kombinatsioonide annustamisrežiime, muutes ravi võimalikult efektiivseks ja vähendades seeläbi resistentsuse levikut.

 

Bakterirakkudel põhinevatel biosensoritel on mitmeid eeliseid. Tavapärased analüüsimeetodid, näiteks spektroskoopia, on väga täpsed, kuid nendega töötamine nõuab palju aega ja lisakulutusi. Seevastu bakteritel põhinevad biosensorid on ökonoomsed, sest kogu analüüsiks vajalik “masinavärk” sisaldub silmale nähtamatutes rakkudes. Baktereid on lihtne laboritingimustes kasvatada, mis muudab nad ensüümidel ja antikehadel põhinevatest biosensoritest märksa odavamaks. Lisaks on bioreporterid väga tundlikud, reageerivad juba väikesele detekteeritava aine kogusele ning võimaldavad analüüsida keerukaid segusid. Samuti on reporterrakkude abil võimalik koguhulgast tuvastada alampopulatsioone, kes reageerivad mõjurile mingil põhjusel teistest erinevalt. Tegemist on atraktiivse uurimisvaldkonnaga, sest insenergeneetilised meetodid võimaldavad disainida bioreportereid väga erinevate ühendite äratundmiseks.

Vahendas Ülar Allas