Bakteri ribosoom

Bakteri ribosoomis on üle 50 erineva valgu. Need valgud (r-valgud) on enamuses väikesed, aluselised polüpeptiidid, mis seonduvad rRNA kindlate piirkondandega ja stabiliseerivad ribosoomi ruumilist struktuuri, kontrollivad rRNA liikumist, aitavad ribosoomi alaühikuid koos hoida samal ajal võimaldades neil teineteise suhtes liikuda, abistavad nii ribosoomiga seonduvatel valkudel kui RNAdel (tRNA, mRNA, tmRNA) ribosoomiga spetsiifiliselt seonduda. Lisaks on neil väga olulised funktsioonid ribosoomide kokkupakkimisel ja mõnelgi neist on ka funktsioone väljaspool ribosoomi. Järelikult on r-valkudel palju erinevaid ja olulisi funktsioone nii ribosoomis kui väljaspool seda.

Kaua aega arvati, et kõik ribosoomid on enam-vähem identsed ja nad sünteesivad valke täpselt ühte moodi. Viimastel aastakümnetel on määratud genoomide nukleotiidne järjestus väga paljudes liikides. On selgunud, et rRNAl on palju või väga palju geene ja r-valkudel on mitmeid geene. Nendel paraloogilistel geenidel on vähem või rohkem järjestuse erinevusi ja nad avalduvad erinevalt sõltuvalt rakutüübist või elukeskkonna muutustest. See asjaolu viis teadlased ideeni, et erinevaid mRNA molekule transleerivad erinevad ribosoomid. Uurisime seda hüpoteesi (nn „filter“ hüpoteesi) bakteris E. coli, kelle ribosoomides on kahe r-valgu jaoks kaks paraloogset geeni. Need valgud kannavad nimesid bL31 (A ja B paraloogid) ning bL36 (A ja B paraloogid) (vt joonis allpool). Tegime kindlaks, et kõigi nelja geeni produktid lülituvad E. coli ribosoomidesse ja toetavad valgusünteesi sarnase efektiivsusega. Olime esimesed, kes nägid, et bL31B lülitub E. coli ribosoomidesse ja bL36B on üldse ribosoomi valk. Koostöös J. Cate’i ja A. Pulgaga õnnestus määrata ka B valkude ruumiline struktuur ribosoomides. Huvitaval kombel sisaldavad erinevates kasvufaasides olevad E. coli rakud erineva koostisega ribosoome. Seejuures asendatakse olemasolevates ribosoomides bL31 ja bL36 valgud teiste paraloogidega. Kiire kasvu puhul, kui ribosoomide hulk rakus on kasvu limiteeriv tegur, on ribosoomides A paraloogid ja üleminekul statsionaarsesse kasvufaasi asendatakse need B paraloogidega. Meie tulemused võimaldavad järeldada, et vähemalt soolekepikese puhul suudavad erineva r-valkude koostisega ribosoomid sünteesida kõiki valke ja „filter“ hüpotees ei pea paika. Pigem seostub ribosoomide heterogeensus kasvutingimuste erinevustega.

rRNA (hele) ja r-valgud (tumedam)

väike subühik – sinine; suur subühik – hall ja violetne

bL31 – roheline

bL36 – pruun

Pildi autor Arto Pulk

Ribosoomide kõige massiivsem komponent on RNA molekulid (rRNA). Ribosoomi valgud (r-valgud) on väikese massiga valgud, aga neid on palju (bakteri ribosoomis 53 erinevat valku). Ribosoomi ruumilise struktuuri määrab eelkõige rRNA struktuur, mida stabiliseerivad r-valgud. Ribosoomide biogeneesi käigus osalevad lisaks r-valkudele ka mitmed mitteribosoomsed valgud (assembly faktorid). rRNA elemendid moodustavad ribosoomide aktiivtsentrid, piirkonnad kus toimub mRNA ja tRNA paardumine (dekodeeriv tsenter ribosoomi väiksemal alaühikul) ja peptiidsideme sünteesi katalüüsiv tsenter (peptidüültransferaasne tsenter suuremal alaühikul). rRNA on sarnaselt valgulistele ensüümidele katalüsaator. Ka tema struktuur on analoogne valkude struktuurile, lineaarsed järjestuse osas (primaarstruktuuri elemendid) moodustavad ruumilise struktuuri domeene (domeen – iseseisvalt struktuuri moodustav üksus).

Modifikatsioonide paigutumine ribosoomi suuremas subühiku rRNAs. Eri värvid tähistavad erinevatel ribosoomi kokkupaneku etappidel sünteesitavaid modifikatsioone.

Kõigi ribosoomide RNA sisaldab lisaks tavapärastele nukleotiididele (A,C,G,U) ka mitmeid mittestandardseid nukleotiide, mis sünteesitakse rRNA ahelatesse tavapäraste nukleotiidide muutmise teel, peale seda, kui rRNA ahel on juba sünteesitud aga ribosoom ei veel päris lõplikult kokku pandud. Modifitseeritud nukleotiidid paiknevad bakteri ribosoomides funktsionaalsete tsentrite ja ribosoomi subühikuid ühendavate sildade läheduses. Modifitseeritud nukleotiidide struktuur, asukoht ribosoomis ja neid sünteesivad ensüümid on küll teada, kuid nende bioloogiline roll ribosoomides on enamasti mõistatuslik. Hiljuti õnnestus meie töögrupil välja selgitada, et mitmed rRNA modifikatsioonid ja neid sünteesivad ensüümid osalevad aktiivselt ribosoomide ruumilise struktuuri moodustamisel. Meie tööd näitavad, et rRNA modifitseerimine ja ribosoomide kokkupakkimine on vastastikku teineteist võimendavad. Jätkame üksikute rRNA modifikatsiooniensüümide osa uurimist ribosoomide kokkupankul.

Selgitame rRNA modifitseeritud nukleotiidide tähtust ribosoomi funktsioneerimisel st valkude sünteesil. Uurime modifikatsioonide puudumise mõju valgusünteesi efektiivsusele aga samuti antibiootikumide tundlikkusele. Paljude antibiootikumide märklauaks on bakteri ribosoom. See annab alust oletada, et rRNA modifikatsioonid mõjutavad valgusünteesi pidurdamist antibiootikumide poolt. Nendes uurimustes kasutame E. coli tüve milles puuduvad paljud modifikatsiooniensüümid. Sellele tüvele ühe kaupa kas natiivseid või katalüütiliselt inaktiivseid ensüüme lisades saame kindlaks teha millist rolli vastav ensüüm ja tema poolt sünteesitav modifikatsioon täidavad.

Kasutame nii geneetika kui biokeemia meetodeid. Struktuuribioloogia osas teeme koostööd eelkõige prof. M Selmeri grupiga Uppsala Ülikoolis, Rootsi kuningriigis. Teeme aktiivset koostööd meie instituudi mikroobigeneetikutega (Prof. M. Kivisaare rühmaga) tRNA modifikatsioonide ja translatsioonitäpsuse ning nende seosest mutatsioonisagedusega.

Lisainformatsioon: prof. Jaanus Remme (jremme@ut.ee) või kaasprof. Aivar Liiv (aivar.liiv@ut.ee)

OLULISED PUBLIKATSIOONID

Ero, R., Leppik, M., Reier, K., Liiv, A., Remme, J. (2024) Ribosomal RNA modification enzymes stimulate large ribosome subunit assembly in E. coli. Nucleic Acids Res. 52, 6614–6628

Ribosoomivalkude uurimisel kasutame eelkõige proteoomika meetodeid. Kasutades bakteri valkude metaboolset märkimist stabiilsete isotoopidega koos kvantitatiivse mass-spektromeetriaga uurisime nii r-valkude kui paljude teiste valkude eluiga bakterites. Oli üllatav leida, et osa r-valke lagundatakse kuna teine osa jääb peale ribosoomide lagunemist alles. Need tulemused aitavad selgitada bakterite stressitaluvust ja taasärkamist kiirele kasvule, kui elutingimused paranevad.

Lisainformatsioon: kaasprof. Aivar Liiv (aivar.liiv@ut.ee) või prof. Jaanus Remme (jremme@ut.ee)

OLULISED PUBLIKATSIOONID

Lilleorg, S., Reier, K., Pulk, A., Liiv, A., Tammsalu, T., Peil, L., Cate, J.H.D., Remme, J. (2019) Bacterial ribosome heterogeneity: Changes in ribosomal protein composition during transition into stationary growth phase. Biochimie, 169-180.

Reier, K., Lahtvee, P-J., Liiv, A., Remme, J. (2022) A Conundrum of r-Protein Stability: Unbalanced Stoichiometry of r-Proteins during Stationary Phase in Escherichia coli. mBio 13, (5) e01873-22