{"id":552,"date":"2024-09-23T14:05:56","date_gmt":"2024-09-23T11:05:56","guid":{"rendered":"https:\/\/sisu.ut.ee\/ribolab\/?page_id=552"},"modified":"2025-02-14T15:24:17","modified_gmt":"2025-02-14T13:24:17","slug":"parmi-ribosoomid-projekt","status":"publish","type":"page","link":"https:\/\/sisu.ut.ee\/ribolab\/parmi-ribosoomid-projekt\/","title":{"rendered":"Eukar\u00fcootide ribosoom"},"content":{"rendered":"

EUKAR\u00dcOOTIDE RIBOSOOM<\/strong><\/h2>\n\n\n\n
<\/div>\n\n\n\n
\n

Programmeeritud valgus\u00fcnteesi viib rakkudes l\u00e4bi molekulaarne nanomasin \u2013 ribosoom<\/strong>. Ribosoomid on k\u00f5igis elusorganismides sarnase ehitusega ning nende ruumiline struktuur on evolutsiooniliselt k\u00f5rgelt konserveerunud. Ribosoomi p\u00f5histruktuuri moodustavad umbes 4400 RNA nukleotiidi (ribosomaalne RNA, rRNA) ning 33 ribosoomivalku (r-valk). P\u00f5histruktuur sisaldab k\u00f5iki ribosoomi funktsionaalseid keskusi \u2013 dekodeeriv tsenter, peptid\u00fc\u00fcltransferaasne tsenter, GTPaasidega seondumise piirkod, peptiidi v\u00e4ljumise tunneli algus ning A-, P- ja E-saidid kuhu seonduvad tRNA molekulid. Sellele vaatamata on valgus\u00fcnteesi aparaat prokar\u00fcootides (eeltuumsed) ja eukar\u00fcootides (p\u00e4ristuumsed) erinev mitmes olulises aspektis. Eukar\u00fcootide ribosoomid on m\u00e4rkimisv\u00e4\u00e4rselt suuremad ning keerukama ehitusega. Lisandunud on rRNA j\u00e4rjestusi, r-valkude j\u00e4rjestusi ning uusi r-valke.<\/p>\n<\/div>\n\n\n\n

\"\"<\/figure>\n\n\n\n
\n

Pagarip\u00e4rmi Saccharomyces cerevisiae<\/em> ribosoomi 40S ja 60S ala\u00fchikute struktuur. Ribosomaalne RNA ja universaalselt konserveeritud ribosoomi valgud on t\u00e4histatud hallilt ja tumesiniselt. Arhede\/eukar\u00fcootide spetsiifilised valgud on v\u00e4rvitud punaselt. Domeeni spetsiifilised valgud on t\u00e4histatud kollaselt. N\u00e4idatud on tRNA-de seondumise (A-, P- ja E-saidid) ligikaudne asukoht. Joonise tegemisel on kasutatud S. cerevisiae <\/em>80S ribosoomi 3D struktuuri (PDB koordinaadid 4V88) (Ben-Shem et al<\/em>., 2011<\/a>) ning programmi PyMol<\/em>.<\/p>\n\n\n\n

<\/div>\n\n\n\n
\n

Arhede\/eukar\u00fcootide spetsiifilised r-valgud ning nende poolt moodustunud ala\u00fchikuid \u00fchendavad kontaktid.<\/strong><\/p>\n\n\n\n

Pagarip\u00e4rmi ribosoom, nagu iga eukar\u00fcootne ribosoom, koosneb v\u00e4ikesest (40S)<\/strong> ja suurest (60S) <\/strong>ribosomaalsest ala\u00fchikust<\/strong>. Valgus\u00fcnteesi initsiatsioonil moodustavad need ala\u00fchikud funktsionaalse 80S ribosoomi<\/strong>.
Ala\u00fchikute \u00fchinemisel moodustuvad spetsiifilised kontaktid ehk ala\u00fchikute vahelised sillad<\/strong>. Pagarip\u00e4rmi ribosoomi struktuurne mudel kirjeldab 17 silda. Nendest 12 silda on evolutsiooniliselt konserveerunud. Konserveerunud sillad asuvad ribosoomi p\u00f5histruktuuris ning sisaldavad RNA-RNA, RNA-valk ja valk-valk vahelisi kontaktide. Konserveerunud sildade funktsioone on p\u00f5hjalikult uuritud. Need on olulised translatsiooni protsessiivsuse ja translatsiooni t\u00e4psuse tagamisel ning translokatsioonil ja ribosoomide rotatsiooni regulatsioonis.
Ala\u00fchikute vahelistest sildadest on viis silda spetsiifilised just eukar\u00fcootide ribosoomidele. Need sillad moodustuvad t\u00e4nu RNA-valk ja valk-valk kontaktidele. Sildade tekkimisel on olulised ribosoomi eukar\u00fcoodi spetsiifilised struktuursed elemendid. Neli ala\u00fchikute vahelist silda (eB8, eB11, eB12 ja eB13) paiknevad ribosoomi perifeersetes regioonides. Ainult \u00fcks eukar\u00fcoodi-spetsiifiline sild, eB14, asub ribosoomi p\u00f5histruktuuris. Eukar\u00fcoodi spetsiifiliste sildade roll ribosoomi funktsionaalsuse jaoks on v\u00e4hem uuritud. Meie poolt l\u00e4bi viidud uuringud on esimesed s\u00fcsteemsed anal\u00fc\u00fcsid, et selgitada v\u00e4lja eukar\u00fcoodi spetsiifiliste ala\u00fchikute vaheliste sildade funktsioonid.<\/p>\n\n\n\n

\"\"<\/figure>\n\n\n\n

Pagarip\u00e4rmi Saccharomyces cerevisiae<\/em> 80S ribosoomi struktuur. N\u00e4idatud on suur ala\u00fchik (60S, helepruun) ja v\u00e4ike ala\u00fcksus (40S, helehall). T\u00e4histatud on kolm eukar\u00fcootidele iseloomulikku ala\u00fchikute vahelist silda: eB12, eB13 ja eB14. Neid sildu moodustavad: ribosoomivalgud eL19 (helesinine), eL24 (tumesinine), eL41 (roheline), eS6 (lilla), eS7 (kollane) ja rRNA j\u00e4rjestused (punane). Joonise tegemisel on kasutatud S. cerevisiae <\/em>80S ribosoomi 3D struktuuri (PDB koordinaadid 4V88) (Ben-Shem et al<\/em>., 2011<\/a>) ning programmi PyMol<\/em>.<\/p>\n<\/div>\n\n\n\n

\n

Oma uurimist\u00f6\u00f6s keskendume ribosoomi eukar\u00fcoodi spetsiifilisetele sildadele<\/strong>. Nende sildade olulisteks komponentideks on r-valgud, mis bakterites puuduvad. Seda spetsiifilist r-valkude r\u00fchma nimetatakse arhede\/eukar\u00fcootide spetsiifilisteks (A\/E-spetsiifilised) r-valkudeks (vt. p\u00f5hjalikumat \u00fclevaadet: Kisly ja Tamm, 2023<\/a>). R-valgud eL19<\/strong> ja eL24<\/strong> koosnevad kolmest domeenist: N-terminaalne domeen, keskmine regioon ja C-terminaalne \u03b1-heelikaalne domeen. M\u00f5lema valgu pikad C-terminaalsed domeenid<\/strong> osalevad ala\u00fchikute vaheliste eukar\u00fcoodi spetsiifiliste sildade eB12<\/strong> ja eB13<\/strong> moodustamisel.
Oleme konstrueerinud p\u00e4rmit\u00fcved, mis ekspresseerivad r-valkude variante, milles puuduvad silla moodustamiseks vajalikud j\u00e4rjestused. Sillad eB12 ja eB13 on \u00fclit\u00e4htsad pagarip\u00e4rmi ribosoomi funktsionaalsuse jaoks (Kisly et al<\/em>., 2016<\/a>; Kisly et al<\/em>., 2019<\/a>). Need sillad tagavad ribosoomi ala\u00fchikute kokkusaamise, mis toimub translatsiooni initsiatsiooni etapis.
Valgu eL19 deletsioonimutantide anal\u00fc\u00fcsil selgus, et eB12 silla funktsionaalsus s\u00f5ltub valk-rRNA interaktsioonidest valgu eL19 ja 18S rRNA lisasegmendi ES6S vahel.\u00a0 Kuigi eB12 sild ei ole eluks h\u00e4davajalik, on see erakordselt oluline ribosoomi optimaalseks toimimiseks. Silla eB13 funktsioneerimise tagavad eelk\u00f5ige valk-valk interaktsioonid valkude eL24 ja eS6 vahel.
Ala\u00fchikute vaheliste sildade kooperatiivsuse<\/strong> anal\u00fc\u00fcsimiseks kasutasime pagarip\u00e4rmi t\u00fcvesid, kus ribosoomides puuduvad erinevad sildade eB12, eB13 ja eB14 kombinatsioonid (Tamm et al<\/em>, 2019<\/a>). N\u00e4itasime, et need sillad ei funktsioneeri s\u00f5ltumatult, vaid t\u00e4idavad \u00fcksteist ning toetavad \u00fcheskoos ribosoomi funktsionaalsust.
Mutantsete ribosoomide iseloomustamiseks t\u00f6\u00f6tasime v\u00e4lja uue meetodi<\/strong>, mis p\u00f5hineb rakuvabas translatsioonis\u00fcsteemis<\/strong> liitvalgu <\/em>Renilla-Firefly<\/em> s\u00fcnteesil<\/strong> (Kisly et al<\/em>., 2021<\/a>). See meetod v\u00f5imaldab m\u00e4\u00e4rata ribosoomide elongatsioonikiirust ja protsessiivsust ja seda s\u00f5ltumatult valgus\u00fcnteesi initsiatsiooni ja terminatsiooni etappidest. Lisaks saab m\u00e4\u00e4rata ribosoomide seiskumist spetsiifilistel mRNA j\u00e4rjestustel.<\/p>\n\n\n\n


K\u00e4imasolevad projektid keskenduvad translatsiooni initsiatsiooni uurimisele. Anal\u00fc\u00fcsime valgus\u00fcnteesi alustamist spetsiaalsetelt RNA elementidelt (IRES, sisemine ribosoomi seondumispiirkond). Kilgi halvatuse viirus<\/strong> sisaldab IRES regiooni<\/strong>, mis t\u00f6\u00f6tab lisaks putukarakkudele ka p\u00e4rmirakkudes. Seega on v\u00f5imalik kasutada selle IRES-e uurimiseks Drosophila<\/em> S2 rakuliini ning pagarip\u00e4rmi erinevaid t\u00fcvesid. Anal\u00fc\u00fcsime kuidas toimub IRES-e poolt algatatud valgus\u00fcntees mutantseid ribosoome sisaldavates rakkudes. Lisaks anal\u00fc\u00fcsime translatsiooni initsiatsioonis olulise IRES RNA-80S ribosoomi kompleksi moodustumist kui puuduvad m\u00f5ned ribosoomivalgud v\u00f5i ribosoomivalkude domeenid.<\/p>\n\n\n\n

<\/div>\n\n\n\n

Modifitseeritud nukleotiidid ribosoomi RNAs<\/strong><\/p>\n\n\n\n

Ribosoomide RNA sisaldab lisaks tavap\u00e4rastele nukleotiididel ka modifitseeritud nukleotiide. Need modifikatsioonid lisatakse rRNA molekulidesse p\u00e4rast transkriptsiooni, ribosoomi k\u00fcpsemise k\u00e4igus. K\u00f5ige levinumad modifikatsioonid rRNA-s<\/strong> on riboosi 2\u2019-O-met\u00fclatsioonid ja uridiini isomerisatsiooni tagaj\u00e4rjel tekkinud pseudouridiinid. Lisaks on kirjeldatud veel erinevaid l\u00e4mmastikaluste modifikatsioone. Evolutsiooni k\u00e4igus on modifitseeritud nukleotiidide hulk muutunud. Kui bakteri E. coli<\/em> rRNA sisaldab 36 modifitseeritud positsiooni, siis pagarip\u00e4rmi rRNA-s on neid juba \u00fcle 100 ning inimese rRNA-s \u00fcle 200. Evolutsiooni k\u00e4igus on muutunud ka mehhanismid kuidas neid modifikatsioone rRNA-sse lisatakse. Bakteris viivad vastavaid reaktsioone l\u00e4bi spetsiifilised ens\u00fc\u00fcmid. Arhedes ja eukar\u00fcootides on lisaks spetsiifilistele ens\u00fc\u00fcmidele kasutusel ka v\u00e4ikestel tuumakese-spetsiifilistel RNA-del (snoRNA) p\u00f5hinev s\u00fcsteem.
rRNA modifitseeritud nukleotiidid ei ole \u00fchtlaselt ribosoomi struktuuris jaotunud vaid grupeeruvad ribosoomi funktsionaalselt olulistesse keskustesse: tRNA seondumise saidid, peptid\u00fc\u00fcltransferaasi tsenter, dekodeerimise tsenter, peptiidi v\u00e4ljumise tunnel ja sub\u00fchikute vahelised sillad. Bakteri E. coli<\/em>, pagarip\u00e4rmi S. cerevisiae<\/em> ning inimese rRNAs paiknevate modifitseeritud nukleotiidide anal\u00fc\u00fcsil selgus, et vaid \u00fcheksal juhul paiknevad need evolutsiooniliselt konserveerunud positsioonides. Neli positsiooni<\/strong> asuvad suure ala\u00fchiku peptid\u00fc\u00fcltransferaasse tsentri<\/strong> piirkonnas.<\/p>\n\n\n\n

\"\"<\/figure>\n\n\n\n

Pagarip\u00e4rmi Saccharomyces cerevisiae<\/em> 80S ribosoomi struktuur koos peptid\u00fc\u00fcltransferaasse tsentri l\u00e4hivaatega. Joonisel on n\u00e4idatud rRNA modifitseeritud nukleotiidid, mille olulisust uuriti Leppik et al., 2024<\/a>. Evolutsiooniliselt konserveerunud modifikatsioonid on v\u00e4rvitud punaseks.<\/p>\n<\/div>\n<\/div>\n\n\n\n

\n

Peptid\u00fc\u00fcltransferaasse tsentri \u00fcmbruses paiknevate rRNA modifikatsioonide funktsiooni uurimiseks konstrueerisime p\u00e4rmit\u00fcved, millel puudusid kolm snoRNA geeni ja\/v\u00f5i mis ekspresseerisid kahe ribosoomi biogeneesis osaleva faktori ens\u00fcmaatiliselt inaktiivseid variante (vt. teadusartiklit Leppik et al<\/em>. 2024<\/a>). Saadud p\u00e4rmit\u00fcvi oli k\u00fcll eluj\u00f5uline kuid seitsme modifitseeritud nukleotiidi puudumine<\/strong> p\u00f5hjustas rakkude kasvu aeglustumist ja k\u00fclmatundlikkust. Lisaks toimus translatsioon mutantsetes rakkudes aeglasemalt ning t\u00e4psemalt. Seega tagab peptid\u00fc\u00fcltransferaasses tsentris olev rRNA modifitseeritud nukleotiidide muster optimaalse ribosoomi aktiivsuse ning translatsiooni t\u00e4psuse.<\/p>\n\n\n\n


Edasine uurimist\u00f6\u00f6 keskendub evolutsiooniliselt konserveerunud modifitseeritud nukleotiidide olulisuse anal\u00fc\u00fcsimisele. Kasutame konstrueeritud mutantseid p\u00e4rmit\u00fcvesid ning viime nendesse tagasi funktsionaalsed snoRNA-d ning ens\u00fcmaatiliselt aktiivsed biogeneesi faktorid. Anal\u00fc\u00fcsime nendes t\u00fcvedes t\u00f6\u00f6tavate ribosoomide aktiivsust ning translatsioonilist t\u00e4psust. Selline ribosoomide \u201eparandamise\u201c strateegia<\/strong> v\u00f5imaldab selgitada \u00fcksikute modifitseeritud nukleotiide rolli ribosoomi funktsionaalsuse tagamisel.<\/p>\n\n\n\n

<\/div>\n<\/div>\n\n\n\n
\n
\n

KAITSTUD Doktorit\u00f6\u00f6d <\/strong><\/p>\n<\/div>\n\n\n\n

\n
\n
\n

2019
Ivan Kisly<\/strong><\/p>\n<\/div>\n\n\n\n

\n

The pleiotropic functions of ribosomal proteins eL19 and eL24 in the budding yeast ribosome<\/a>
<\/p>\n<\/div>\n\n\n\n

\n

Juhendajad:
Tiina Tamm,
Jaanus Remme<\/p>\n<\/div>\n<\/div>\n<\/div>\n<\/div>\n\n\n\n