Süstikpeptiidid näitavad teed tulevikku

Professor Ülo Langeli juhitud molekulaarse biotehnoloogia töörühm tegeleb süstikpeptiidide uuringutega. Süstikpeptiidide mõiste ilmus eesti keelde üsna hiljuti. Nii nimetatakse lühikesi, 5 - 30 aminohappest koosnevaid molekule, mis on võimelised läbima rakumembraane, ilma neid sealjuures lõhkumata. Varem on süstikpeptiide nimetatud ka rakku tungivateks peptiidideks, kullerpeptiidideks ja Trooja peptiidideks. Inglise keeles on vastav termin cell-penetrating peptides. Hiljuti ilmus kirjastuselt Springer professor Langeli mahukas teos „CPP, Cell-Penetrating Peptides“. Samuti nägi asja ilmavalgust ka Ülo Langeli ja Kaido Kurrikoffi ülevaateartikkel süstikpeptiidide rakendustest meditsiinis.

Süstikpeptiidid avastati 1988. aastal sõltumatult kahe USA teadlaste rühma poolt. Mõlemad grupid töötasid HI-viiruse valguga Tat. Märgati, et see valk on võimeline kiiresti imenduma koekultuuris kasvavate rakkude sisemusse. Esialgu arvasid paljud teadlased, et selline nähtus pole üleüldse võimalik. Mõni aasta hiljem selgus, et 16 aminohappe pikkune fragment äädikakärbse valgust Antennapedia suudab samuti läbi rakumembraani liikuda. See fragment valgust nimetati penetratiiniks. Tänapäeval tuntakse sadu süstikpeptiide, millest suur osa on sünteesitud laborites. Nende rakku tungimise võimet on kunstlikult võimendatud. Tuntakse ka kimäärseid süstikpeptiide, mis on üles ehitatud looduses esinevatest ja kunstlikest osadest.

Edaspidi näidati, et süstikpeptiide saab kasutada vahendina teiste molekulide rakkudesse toimetamiseks. Transporditav molekul (ehk lastmolekul) liidetakse süstikpeptiidi külge ning moodustunud kompleks või konjugaat on võimeline kanduma läbi rakke ümbritseva membraani. Praeguseks on sellisel moel suudetud edukalt rakkudesse transportida ravimeid, valke, nukleiinhappeid, antikehi ja teisi biomolekule. Lastmolekuli mass võib olla süstikpeptiidist mitmeid kordi suurem ja üldjuhul ei mõjuta membraani läbimine lastmolekuli omadusi.

Enamasti satuvad süstikpeptiidid rakkudesse endotsütoosi teel. See on protsess, mille käigus rakk absorbeerib endasse väliskeskkonnas leiduvaid substantse. Endotsütoosi käigus voltub rakumembraan sissepoole ja moodustab lastmolekuli ning peptiidi ümbritseva põiekese, mis neelatakse raku sisemusse. Teatud juhtudel võib peptiid liikuda läbi membraani ka otsesel teel. Täpsed membraani läbimise üksikasjad vajavad veel selgitamist.

Süstikpeptiididele omistatakse suurt rolli tuleviku meditsiinis, sest need pakuvad uute ravimite arendamiseks täiesti uudseid võimalusi. Mitmed paljulubavad ravimimolekulid on heidetud kõrvale juba testimise esimestes etappides, kuna nad pole võimelised suuruse või laengu tõttu rakkudesse sisenema. Süstikpeptiididel põhineva transportsüsteemi kasutamine võimaldaks sellest probleemist üle saada ja ravimikandidaatide hulka märgatavalt suurendada.

Suurt tähelepanu on pühendatud võimalustele süstikpeptiidide kasutamiseks vähiravis. Süstikpeptiidide abil loodetakse ravimeid saata otse haigestunud rakku. Sellisel juhul jäävad ära keemia- ja kiiritusravi kahjulikud kõrvaltoimed. Tänu uudsele transpordisüsteemile paraneb ravimite spetsiifilisus ja ravimiresistentsuse tekkimine peaks muutuma vähem problemaatiliseks. Süstikpeptiidid suudavad ületada organismi vere-aju (hemato-entsefaalse) barjääri, mistõttu osutub võimalikuks ka ajus toimuvate protsesside mõjutamine. Märgid näitavad, et nii-öelda klassikaliste ravimite aeg on meditsiinis läbi saamas või vähemasti uuendumas.

Süstikpeptiidid pakuvad võimalusi geeniteraapia arendamiseks. Viimastel aastakümnetel läbi viidud molekulaargeneetilised uuringud on märkimisväärselt avardanud meie arusaamu haiguste olemusest. Mitmed haigused on seotud geenimutatsioonidega või vigase geeniekspressiooniga. Mitmel juhul on teada, millise geeni ekspressiooni tuleb haiguse ravimiseks võimendada või pärssida. Paralleelselt on arendamisel ka uued meditsiinitehnoloogiaid, mille abil saab rakusiseseid protsesse mõjutada.

Elektronmikroskoobi foto süstikpeptiididest ja siRNA-st moodustunud nanopartiklitest (Porosk jt, Biomaterials Science, 2019).

Juba 20 aastat on teada, et geeniekspressiooni taset on võimalik reguleerida nn vaigistava RNA (siRNA) abil. Tegemist on lühikeste kaheahelaliste RNA molekulidega, mis pärsivad kindla nukleotiidse järjestusega geenide ekspressiooni. Vastavat protsessi nimetatakse RNA interferentsiks. siRNA on võimas vahend, mida on juba testitud näiteks vähigeenide vaigistamisel ja viirusinfektsioonide ravil. Paraku on siRNA molekulid õrnad ja kipuvad kergesti lagunema. Lisaks valmistab probleeme nende sihtpunkti toimetamine, sest siRNA molekulid ei lähe kergesti läbi rakumembraani. Sobiliku transpordisüsteemi puudumine ongi peamine põhjus, miks siRNA-de kasutamine teraapias pole veel levinud. Süstikpeptiidide abil võiks siRNA-de transport sihtkohta muutuda efektiivsemaks ja ühtlasi pakkuda kaitset lagundavate ensüümide eest. Käesoleva aasta septembris ilmuski ajakirjas Biomaterials Science TÜ teadlaste artikkel, mis käsitleb süstikpeptiidide kasutamise võimalusi siRNA transpordiks rakkudesse.

Tartu ülikooli, Stockholmi ülikooli ja Tartu biotehnoloogiafirma Icosagen Cell Factory koostöös on loodud süstikpeptiidide sari NickFect, mida on edukalt kasutatud DNA transpordiks rakkudesse. Nüüd seadis Tartu molekulaarse biotehnoloogia töörühm eesmärgiks arendada sama sarja peptiide nii, et need sobiksid läbi viima ka siRNA transporti. Töö esimeses osas disainiti süstikpeptiidi NickFect55 baasil rida uusi peptiide, mis erinesid üksteisest aminohappelise järjestuse poolest. Aminohappeline järjestus määrab ära peptiidi omadused, näiteks laengu, hüdrofoobsuse määra ja pH-tundlikkuse. Need parameetrid mõjutavad omakorda peptiidi rakku jõudmise efektiivsust. Samal ajal tuleb pöörata tähelepanu peptiidi ja siRNA kompleksi stabiilsusele. Lastmolekuli seondumine peptiidiga ei tohi olla liiga nõrk ega liiga tugev, sest pärast rakku jõudmist peab siRNA peptiidi küljest vabanema ja säilitama bioloogilise aktiivsuse. Paljud süstikpeptiidid sisaldavad lüsiini ja arginiini, mis on positiivse laenguga aminohapped. NickFect55 on mõnevõrra eriline, kuna selles sisaldub ka aminohape ornitiin, mida tavaliselt valkudes ei leidu. Ornitiin suurendab peptiidi stabiilsust. 

Sûnteetilise NickFect55 alguses paiknevad aminohapped asendati histidiini jääkidega. Seeläbi muudeti peptiidide laeng positiivsemaks. Süstikpeptiidi positiivne ja siRNA negatiivne laeng soodustavad nende omavahelist seondumist. Samal eesmärgil lisati peptiididele erineva pikkusega rasvhappeid. Järgnevalt hinnati, mil määral on uued peptiidid suutelised seonduma lastmolekuliga, läbima rakumembraani ning osalema geeniekspressiooni reguleerimisel. Katsed näitasid, et kõige tõhusamalt tuli nende ülesannetega toime peptiid NickFect70. Elektronmikroskoobi fotodelt võib näha, et NickFect70 moodustab koos siRNA’ga kerajaid nanopartikleid, mille läbimõõt on umbes 40 nm. Sellised kompleksid on stabiilsed ja kaitsevad siRNA-d lagunemise eest.

Selgus, et NickFect70 vahendab edukalt geeniekspressiooni allasurumist imetaja rakkudes. Hiirtele süstitud NickFect70 oli võimeline toimetama siRNA maksa ning blokeerima seal testimiseks valitud vere hüübimise faktor VII geeni. Seega on Tartu laboris loodud tõhus transpordisüsteem nukleiinhapete toimetamiseks rakkudesse.

Rakumembraani saab muuta läbilaskvaks mitmesuguste füüsikaliste meetoditega, näiteks elektriimpulsside, laseri, ultraheli või tugeva magnetvälja abil. Ravimimolekulide rakkudesse toimetamiseks on püütud kasutada ka viirustel põhinevaid transpordisüsteeme. Paraku pole need meetodid piisavalt ohutud. Viirustel põhinevate süsteemide kasutamisega kaasneb tugev immuunvastus. Lisaks võib viiruse nukleiinhappe teatud tõenäosusega siirduda patsiendi genoomi. Seevastu süstikpeptiidid on inimesele ohutud ja nende kasutamine ei tekita organismis immuunvastust. Kui rakkudesse siirdatud peptiidid lagunevad, siis tekivad aminohapped, mis on toitaineteks ja rakkude ehitusplokkideks. Lisaks on nende tootmine suhteliselt odav ja lihtne. Tänaseks on esimesed süstikpeptiidid juba jõudnud kliinilistesse katsetusesse. Esimesed tulemused annavad põhjust optimismiks. Samas on tegemist vägagi keerulise valdkonnaga ja vaja on läbi viia rida täiendavaid uuringuid, enne kui süstikpeptiide saab hakata kasutama näiteks vähkkasvajate ravil või geeniregulatsiooni mõjutamiseks. Professor Langeli kinnitusel võiks ka Eestis tegeleda ravimiarendusega, sest meil on olemas selleks vajalik potentsiaal ja kompetents.

pep synt

                               Peptiidisüntesaator